荧光共振能量转移（Fluorescence Resonance Energy Transfer）是指在两个不同的荧光基团中，如果一个荧光基团（供体 Donor）的发射光谱与另一个基团（受体 Acceptor）的吸收光谱有一定的重叠，当这两个荧光基团间的距离足够近时（一般小于100Å），就可观察到荧光能量由供体向受体转移的现象，即以供体的激发波长激发时，可观察到受体发射的荧光。通过这种方法来判断分子之间是否有相互作用。

激光扫描共聚焦显微镜可用来分析FRET，常用的方法是受体光漂白法和三通道荧光法。受体光漂白法，简单、易用，直接测量，测量较准确，但会对样品造成破坏，不适合对活细胞长期观察；而三通道方法可以保证活细胞状态，适合长时间的观察，但三通道法比较复杂，涉及很多图像的加减，是一种间接计算方法，需要对荧光的串色和渗漏进行校正。

下面是我们用受体光漂白法做的FRET实验：

此实验中供体为TAM，激发波长为559nm；受体为cy5，激发波长为635nm. 首先对样品（供受体都有，存在FRET）在供体激发波长下对供体成像，做一个时间序列，一般5-10张图即可，目的是为了分析成像过程中成像激光可能引起的漂白，设为prebleaching；然后用受体激发光选择一个区域进行漂白（图中中间长方形区域即为漂白区域，漂白时间一般为3-20s，具体多长时间通过实验确定）；漂白后还是在供体激发波长下对供体成像，同样做一个时间序列，一般为5-10张图，设为postbleaching。然后利用软件可得到FRET效率及供受体之间的距离。比较漂白区域ROI2和非漂白区域ROI3、ROI4，可判断是否存在明显的FRET. 漂白区域FRET效率约为39%，非漂白区域约为10%，存在明显的FRET.

图中a为漂白前供体的图片（时间序列的最后一张图片），b为漂白后供体的图片（时间序列的第一张图片），c为FRET效率图，d 为供受体之间距离图，e为漂白后供体图像与漂白前供体图像之差。a、b、e、刻度为荧光强度；c刻度为FRET效率；d刻度为供受体之间的距离，单位nm.