分析测试中心激光共聚焦显微镜最多可同时采集三个荧光通道。两个荧光通道的荧光强度可做Ratio值，用于分析pH值、金属离子浓度等引起的荧光强度比值的变化。
      碳纳米点上修饰两种不同荧光染料（异硫氰酸酯荧光素和罗丹明）(DLCD)，可形成一种可调式比率型 pH荧光探针，用于整个活细胞内pH的分布及其波动的定量检测。下图为Ratio法在pH荧光探针应用方面的举例。
图1为Hela细胞在pH6-8范围的荧光图。第一行为FITC通道（激发波长488nm，发射波长510-550nm）；第二行为RBITC通道（激发波长488nm,发射波长570-610nm）；第三行为微分干涉差图(DIC)；第四行为FITC通道与RBITC通道的荧光强度比值图(ch1/ch2)， 即Ratio图,不同的颜色代表不同的比值，绿色表示Ratio值低，黄色表示Ratio值高，如图2颜色标尺所示。由图1可看出随着pH值的增加，FITC通道荧光强度增加，而RBITC通道荧光强度基本不变，两个通道的荧光强度比值增加。
      图3为一幅Ratio图的Ratio值频率分布，即每个Ratio值对应的像素数，这样我们就可以知道一幅Ratio图中，每个Ratio值的权重或像素与Ratio值的对应关系。Ratio值与像素数的对应关系有excel数据，因数据太多不做展示。通过origin可算出一幅Ratio图的平均Ratio值及误差bar(平均值±标准偏差)。当颜色标尺相同时，一种颜色对应一个Ratio值，一幅图的平均Ratio值又对应细胞的一个pH值。这样，就可以做出pH-Ratio曲线。
      图4 a）显示了pH—Ratio图及误差bar，在pH6-8范围内，成线性，图b)-f)为负载有碳纳米点的Hela细胞的Ratio图。图a为未经处理的完整细胞，图b)-f)为用不同的氧化还原剂处理后的Ratio图，有的颜色变蓝，有的基本没变。可看出不同的氧化还原剂处理细胞后，细胞内pH值有的发生变化，有的没发生变化。这样我们就可以很清楚地用Ratio图颜色的变化来判断pH值的变化。

图1. Fluorescent images of HeLa cells clamped at pH 6.0, 6.5, 6.8, 7.2, 7.5, and 8.0, respectively. The images of the first row (FITC channel) and second row (RBITC channel) were collected in the ranges of 510–550 nm and 570–610 nm, respectively. The third row shows the corresponding differential interference contrast images. The images of the fourth row (the Ratio channel) were generated by Olympus software (FV10-ASW); the bottom color strip represents the pseudocolor change with pH. Scale bar, 20 µm.

图2. Ratio channel, different color represents different Ratio value. Green indicates lower Ratio value, yellow indicates higher Ratio value.