共聚焦显微镜可以做样品的发射光谱。一般来说，样品置于盖玻片上。在一定的取图参数下，盖玻片本身会有荧光。图1—图4分别是405nm、488nm、515nm，559nm激光激发国产盖玻片的发射光谱图。当样品荧光比较强时，我们可以通过调节参数，忽略背景荧光。只选取样品部分做荧光光谱。但是当样品荧光较弱，背景荧光无法排除时，就要既选择样品部分还要选择背景部分做荧光光谱。两者求差才是样品的实际荧光光谱。

  以515nm激光激发样品用共聚焦做荧光发射光谱序列图，发射波长范围530nm-750nm，步进3nm，带宽15nm. 图5是共聚焦所做荧光发射光谱序列图之一。ROI 4,5,6,7是样品部分，ROI 8,9是背景部分（背景荧光包括盖玻片荧光及溶剂的荧光）。分别做样品和背景部分的发射光谱。其中ROI 4,5,6,7的发射光谱包括了样品和背景两部分的发射光谱。图6，图7是用515nm激光激发样品，共聚焦软件做的光谱图。

    从图5可以看出，背景ROI 8,9处荧光很强，同样可做出发射光谱（图6显示）。从图6可看出，背景的发射光谱与样品部分的发射光谱相似，只是强度略低。从共聚焦软件中不仅可得到荧光发射光谱图而且有excel数据（波长-荧光强度），我们只需将样品部分的荧光强度减去背景部分的荧光强度，即可得到样品的实际荧光强度。

波长-荧光强度用origin作图可得荧光发射光谱图。